El primer sistema de producción de penicilina fue el conocido como método de superficie, donde el hongo crecía en la superficie de una capa de medio de cultivo, en bandejas. Pero después de 1944, el desarrollo del método de fermentación sumergida permitió disminuir los requerimientos de espacio y, consecuentemente, los costos de producción. Los fermentadores para la producción de penicilina alcanzan los 20.000 a 115.000 litros de capacidad. El inóculo constituye casi el 10% del cultivo total y se prepara a partir de un cultivo (starter) del hongo preparado de esporas liofilizadas.
El medio de cultivo para la fermentación se compone básicamente de un caldo de maíz, con el agregado de lactosa y compuestos inorgánicos. Después de ajustar el pH (4,5-5,0), el medio de cultivo se pasa al fermentador equipado con un agitador vertical y con un sistema de inyección de aire estéril y serpentinas para mantener la temperatura entre 23 y 25 ºC. El hongo se introduce estérilmente y se inicia la fermentación, durante la cual el aire estéril permite el crecimiento del hongo y la agitación facilita su distribución en el fermentador. Después de unas 50 a 90 horas la tasa de crecimiento del hongo disminuye, el fermentador se enfría a 5 ºC para prevenir la desestabilización del antibiótico y el micelio (hongo) se separa por filtración. La penicilina se extrae posteriormente empleando solventes (acetato de amilo y cloroformo), se concentra y se trata con bicarbonato de sodio para formar la sal sódica. La esterilización de hace por filtración y luego el producto se cristaliza y se envasa en polietileno o frascos de vidrio.
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